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考拉王的桉树
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Qi
#基因编辑#
尽管基因组编辑技术快速发展，但人类已知的超过75,种与疾病相关的基因变异中的大多数，在治疗相关的细胞类型中仍然难以纠正。对于大多数已知的遗传疾病，要研究或解决疾病的潜在原因，需要纠正靶点的突变，而不是对基进行的随机破坏，但目前Cas9技术HDR修复的效率依然很低。鉴于此，哈佛大学的DavidLiu开发了一系列碱基编辑技术，如胞嘧啶编辑器（CBE，C→T或者G→A），腺嘌呤编辑器（ABE，A→G或者T→C），以及先导编辑器（PE，可以修复几乎所有的人类致病突变89%），他也因为这一系列杰出工作而刚刚被评为美国科学院院士。
遗传性酪氨酸血症I型(HT1)，又称先天性酪氨酸血症，则是众多遗传性基因突变疾病之一，由于富马醛乙酰丙酮酶FAH基因第8个外显子末端的G突变成A，造成剪切过程中跳过Exon8，导致FAH失活。FAH缺乏会引起酪氨酸代谢异常、严重肝损伤及肾小管缺陷，可能诱发肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌。
年5月4日，来自韩国汉阳大学的DonghoChoi在Cellstemcell发表题为“Adeninebaseeditingandprimeeditingofchemicallyderivedhepaticprogenitorsrescuegeneticliverdisease”的短文，利用BE和PE对化学衍生的小鼠肝祖细胞进行离体编辑、再移植，达到救治遗传性肝脏疾病的目的。
遗传性酪氨酸血症I型(HT1)是一种常染色体隐性疾病，由富马醛乙酰丙酮酶(FAH)缺乏引起，可诱发肝癌(HCC)。尽管NTBC对HT1有一定疗效，但一些病人对NTBC并不敏感，而且治疗过程依然存在肝癌发生的风险。人们已经尝试过利用基因编辑技术对FAH或其他相关基因进行体内编辑，取得了一些成果，体内编辑策略有一定优势，但对于临床应用也有一些局限性：1、难以控制CRISPR相关工具的转染剂量；2、无法对正确编辑的细胞进行筛选，去除掉具有无关突变或者脱靶效应的细胞。而离体（exvivo）编辑策略可以很好地绕过这些问题，还能避免可能存在的一些免疫反应。本工作中，作者利用先前开发的化学衍生肝组细胞（chemicallyderivedhepaticprogenitors，CdHs）方法得到了HT1小鼠的肝组细胞(mCdHs)，将其用于离体基因编辑治疗。
1、HT1小鼠CdHs细胞的生成和表征
为了获得HT1模型小鼠的mCdHs，作者利用原先开发的方法对小鼠的原代肝细胞（mPHs）进行处理（HAC）。结果发现HAC处理的细胞表达了肝组细胞特有的marker，如Krt19,Sox9和Afp。进一步RNA测序分析结果也表明，HT1-mCdHs细胞转录组范围的表现型与初始的原代肝细胞（HT1-mPHs）存在显著的差异，尤其是细胞周期相关的一些基因在HT1-mCdHs中显著升高。体内的肝祖细胞具有向成熟肝细胞和胆管细胞分化的能力，作者观察到HT1-mCdHs细胞即使在稳定传代23次后，依然具有同时分化为成熟肝细胞和胆管细胞的潜能。
2、突变的HT1-CdHs可以利用BE和PE成功纠正
接着，作者试图建立一个精确的基因编辑方法对HT1-mCdHs进行纠正，修复HT1模型小鼠Fah基因第八个外显子GA点突变。在尝试不同BE方法后，发现NG-ABE8e的效果最后编辑效率为9.2%，但邻近区域的两个A也被编辑，编辑率分别为12.4%和11%。在对PE方法进行一系列优化后，得到了2.3%的编辑效率，无邻近编辑效应。
接着作者稀释分离了正确编辑的HT1-mCdHs细胞系，ABE#1和ABE#2，可惜由于小鼠肝细胞多倍体的特性，即使对ABE#1再次稀释也没能得到纯合子。利用高通量测序对ABE#1-1细胞系进行评价，发现纠正率为13.1%，发现没有明显的脱靶效应。
3、编辑纠正的HT1-mCdHs可以在肝脏再生并延长HT1小鼠存活天数
为了验证纠正后的mCdHs是否能在HT1小鼠中体内再生，作者将部分纠正的HT1-mCdHs-ABE细胞系进移植到HT1小鼠体内，实验结果显示移植纠正细胞系的HT1小鼠肝损伤程度减少，肝切片中发现Fah阳性组织，寿命显著延长，表明纠正后的mCdHs在小鼠体内有很强的再生和分化能力，该体外基因编辑策略可以治疗HT1小鼠的遗传性肝病。因为PE编辑细胞群显示出足够的编辑效率(2.3%)，而且没有临近编辑效应，作者直接将PE纠正后的细胞群移植到小鼠体内，也得到了与ABE编辑细胞系类似的结果。
图1.BE编辑综上，作者开发的离体基因编辑mCdHs策略有许多重要优点：1、无需引入可能会改变基因的外源因子；2、可以在移植之前对编辑效率和脱靶效应进行评估，筛选；3、因为可以在体外对细胞系进行富集，编辑效率不像体内编辑那样要求苛刻，而且电转的方式也比病*更加方便和安全。
总之，考虑到mCdHs的高增殖能力和ABEs和PEs的精确编辑活性，作者开发的体外治疗编辑策略不仅为治疗HT1疾病，而且为其他影响肝脏的遗传疾病开辟了新的途径。
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